אבחנה של סרטן ערמונית מחייבת ביופסייה, המראה תאים סרטניים ברקמת הערמונית. בעוד שבדיקות דם ל PSA ו PSA חופשי, בדיקת שתן ל PCA3, בדיקות דימות דוגמת MRI ובדיקות נוספות יכולות להעריך את הסיכוי למציאת סרטן בביופסיה, רק ביופסיית ערמונית יכולה לאבחן סרטן ערמונית והיא בדיקה נדרשת לפני טיפול בסרטן הערמונית. ביופסיית ערמונית מספקת מידע נוסף פרט לאבחנה של סרטן, כגון מידת האגרסיביות של הסרטן והערכה של גודלו וכמה מבלוטת הערמונית מעורבת בסרטן.
ביופסיית ערמונית מבוצעת בהנחיית אולטראסאונד, המוחדר דרך פי הטבעת ובמהלכה נלקח מספר משתנה של דגימות. ההמלצה היא לדגום לפחות 12 דגימות של הערמונית. חשוב לציין שמכיוון שמדובר בדגימה של בלוטת הערמונית ולא בדיקת כל הבלוטה, ביופסיה שלילית אינה שוללת באופן מוחלט סרטן ערמונית וחלק מהחולים יזדקקו לביופסיה שניה, שלישית ולעיתים אף מספר רב יותר של ביופסיות. שימוש בבדיקת MRI אחרי ביופסיה שלילית, ולקיחת דגימות מאיזורים חשודים ב MRI מעלה את שכיחות מציאת סרטן בביופסיה ויכולה לצמצם את מספר הביופסיות השליליות.
קיימות מספר שיטות אילחוש והרדמה על מנת לצמצם את אי הנוחות והכאב בזמן ביופסיית ערמונית. הדרך המקובלת ושהוכחה כיעילה ביותר היא הרדמה מקומית של הערמונית בעזרת הזרקת חומר הרדמה מקומית (לידוקאין), בדומה להרדמה המקומית אשר מבוצעת אצל רופא השיניים.